تحصيلات تکميلي

تاريخ دفاع : 23/10/80

رشته و گرايش : زيست شناسي-فيزيولوژي گياهي

استاد مشاور : دکتر عليرضا قنادي

نام و نام خانوادگي : ريحانه عموآقايي

دانشكده : علوم

استاد راهنما : دکتر اکبر مستاجران-دکتر گيتي امتيازي

بررسي روابط متقابل بين‌آزوسپيريلوم‌ برازيلنس و سلولهاي ريشه‌ گندم در ‌مراحل اوليه ‌آلوده سازي‌ ريشه

چكيده

آزوسپيريلوم يكي از ريزوباكترهاي تحريك كننده رشد گياهان است كه ريزوسفر غلات و برخي گياهان علفي را كلونيزه نموده و رشد و نمو آنها راتحريك مي نمايد.كلونيزاسيون ريشه يك فاكتوركليدي در كنش موفق بين آزوسپيريلوم و گياه (بطوريكه بتواند منجر به پاسخ هاي رشد و نموي مثبت در گياه شود) به شمار مي رود. بنابراين قبل از كاربرد وسيع اين باكتري در شرايط مزرعه اي، لازم است محققان اطلاعات اساسي‌تري در باره كنش هاي متقابل گياه- ميكرب در ريز و سفر و نحوه كلونيزه شدن ريشه بوسيله آزوسپيريلوم كسب نمايند. در اين راستا موضوع پايان نامه حاضر «بررسي كنش متقابل بين آزوسپيريلوم برازيلنس و سلولهاي ريشه گندم در مراحل اوليه آلوده سازي ريشه» انتخاب شده است.

در اين تحقيق 2 سوش آزوسپيريلوم برازيلنس بكار برده شد. سوش استاندارد ATCC 29145) Sp7) از كمپاني AURIS خريداري شد و سوش Dol (يك سويه بومي ومحلي) از ريشه گندم هاي منطقه دولت‌آباد اصفهان جداسازي شد. كشتهاي خالص باكتري مشخصات زير را نشان مي دادند:

تشكيل يك پرده نازك در زير سطح محيط نيمه جامد Nfb، تشكيل كلني هاي سفيد روي محيط جامد Nfb و كلني هاي صورتي روي محيط BMS ، فعاليت نيتروژنازي، حركت مارپيچي، عدم تشكيل اسپور، مرفولوژي ميله اي كمي خميده و واكنش گرم منفي سلولهاي باكتري.

اولين آزمايش براي ارزيابي بهترين سويه و غلظت مايه تلقيح براي ارقام گندم طراحي شد. براي اين منظور گياهچه هاي گندم از سه رقم زراعي قدس، روشن و اميد با دو سويه Dol و Sp7 از باكتري آزوسپيريلوم با غلظت هاي 109-101 CFU/mL تلقيح شدند و طول ريشه، وزن خشك و تعداد انشعابات ريشه اندازه گيري شد. در همه موارد تلقيح با غلظت 107-106 CFU/mL بيشترين اثر را بر روي رشد و نمو ريشه القاء كرد بنابراين اين غلظت درهمه آزمايش هاي ديگر مورد استفاده قرار گرفت.

در دومين آزمايش، شمارش سوش هاي آزوسپيريلوم در سه منطقه ريشه (ناحيه نوك ريشه، ‌ناحيه رشد طولي و تاركشنده،‌ ناحيه بلوغ ريشه) نشان داد كه محل ترجيحي براي تلقيح ريشه در همه ارقام گندم ناحيه رشد طولي و تاركشنده بوده است. برشهاي عرضي و طولي نشان داد كه سوش Sp7 معمولا با تعداد زياد در اطراف تارهاي كشنده ديده مي شد اما مهمترين محل آلوده سازي براي سويه Dol با سطوح اطراف محل ظهور ريشه هاي فرعي يك گياه تطابق داشت. در مورد محلهاي استقرار اين دو سوش در ريشه ها نيز تفاوتهاي چشمگيري وجود داشت. سوش Sp7 معمولا در سطح ريشه مشاهده گرديد. اما سوش Dol قادر بود فضاهاي بين سلولي در حد فاصل بين اپيدرم و پوست ريشه و يا در لايه هاي خارجي پوست ريشه را نيز تلقيح نمايد.

سومين آزمايش نشان داد كه سوش هاي Dol و Sp7 پيچش و انشعاب دهي تارهاي كشنده را به ترتيب در ريشه ارقام قدس و روشن القاء مي نمايند. در اين مطالعه ماده منشعب كننده تار كشنده كه در عصاره كشتهاي آزوسپيريلوم موجود بود، با كمك كروماتوگرافي لايه نازك شناسايي شد و به عنوان IAA معرفي گرديد. IAA خالص سنتزي نيز قادر بود انشعاب دهي تارهاي كشنده ريشه را تحريك نمايد.

در آزمايش ديگري پاسخهاي كموتاكسي دو سوش آزوسپيريلوم به منظور بررسي نقش احتمالي كموتاكسي در سازگاري اين باكتريها به گياه ميزبانشان مورد بررسي قرار گرفت. براي اين منظوركموتاكسي نسبت به چند قند،‌ اسيد آمينه، اسيد آلي و فلاونوئيد به شيوه كيفي (در پتري ديش) و كمي (در سيستم موئينه) ارزيابي شد. نتايج نشان داد برخي پاسخ هاي كموتاكسي اختصاصي سوش هستند. پاسخ هاي كموتاكسي نسبت به اسيدهاي آلي با ميزان تراوش اين اسيدها از ريشه ميزبان گياهي كه باكتري از آن جدا شده بود، همبستگي داشتند. بالاترين نسبت كموتاكسي با فلاونوئيد نارنجنين بدست آمد. افزودن جاذبها به محلول جذب باكتري، به طور معني داري جذب سوش هاي آزوسپيريلوم برازيلنس به ريشه گياهان را افزايش داد. بالاترين ميزان جذب باكتري نيز در حضور فلاونوئيد نارنجنين بدست آمد. افزودن مواد غير جاذب، كه مي‌توانستند توسط باكتري جذب شوند، موجب شد جذب باكتري به ريشه ها در حد مختصري كاهش يابد.

در ادامه در يك رشته آزمايشات متوالي فعاليت چند آنزيم (لاكاز، پراكسيداز، سلولاز، فيتاز و نيترات ردوكتاز) در عصاره ريشه گياهان آغشته به باكتري در مقايسه باگياهان شاهد غير آلوده اندازه گيري شد. نتايج نشان داد آلوده سازي هيچ اثر معني داري بر ميزان فعاليت آنزيم هاي لاكاز و پراكسيداز ريشه نداشته است. اين نتيجه پيشنهاد مي كند كه آزوسپيريلوم يك ميكرو ارگانيسم مهاجم و بيماري زا نبوده است و در نتيجه واكنش هاي فوق حساسيت در گياه ميزبان را القاء نكرده است در مقابل اثر سوشها روي فعاليت آنزيم هاي ديگر كاملا معني دار بود و نشان مي داد آزوسپيريلوم فيزيولوژي و متابوليسم ريشه را تغيير مي دهد.

تعداد باكتريها در ريشه ارقام گندم آغشته با دو سوش باكتري درريشه هاي پيش تيمار شده با آنزيم هاي سلولاز و پكتيناز با تعداد باكتريها در ريشه هاي تيمار نشده با آنزيم ها (شاهد) مقايسه شد. نتايج نشان داد كه اگر چه ميزان تلقيح ريشه تا حد زيادي در بين تركيب هاي مختلف سوش- رقم زراعي در گياهان شاهد (تيمار نشده با آنزيم) فرق مي كرد (يعني بالاترين تعداد سويه Dol در رقم قدس و از سويه Sp7 در رقم روشن شمارش شد)، پيش تيمار ريشه ها با آنزيم هاي تجزيه كننده پلي ساكاريدهاي ديواره به طور معني داري جذب هر دو سوش به ريشه هر سه رقم گندم را (بدون توجه به تركيب سوش- رقم) افزايش داد. بنابراين ديواره سلول گياهي ممكن است يك سد براي رابطه اختصاصي بين آزوسپيريلوم با گياه ميزبانش باشد و افزايش فعاليت آنزيم هايي مثل سلولاز در ريشه هاي آغشته به باكتري احتمالا يك پيش نياز براي تلقيح موفق ريشه محسوب مي شود.

در آزمايش بعدي اثر اين دو سوش روي تراوش پروتوني و طول ريشه سه رقم گندم تحقيق شد. تلقيح با باكتري هر دو صفت فوق را تقويت كرد و يك همبستگي مثبت بين ميزان تراوش پروتوني، رشد طولي ريشه و ميزان كلونيزاسيون ريشه به اثبات رسيد.

اندازه گيري ميزان تثبيت ازت به كمك روش احياي استيلني نشان داد كه تثبيت ازت به پاسخ هاي رشدي گياه و افزايش محتواي ازت گياه كمك مي كند. پيش تيمار ريشه با نارنجنين ميزان تثبيت ازت راتقويت كرد اما به هر حال ميزان كل تثبيت ازت در سيستم همياري گندم- آزوسپيريلوم كمتر از آن در سيستم لگوم- ريزوبيوم بود.

در كليه آزمايش ها اثر متقابل بين سوش و رقم زراعي كاملا معني دار بود. سويه Sp7 بيشترين ميزان نمو ريشه، تغيير شكل تاركشنده، فعاليت آنزيمها (سلولاز، نيترات ردوكتاز و فيتاز)، تثبيت ازت و تراوش پروتوني در ريشه رقم روشن ايجاد كرد؛ اما سويه Dol بهترين اثر روي اين شاخص ها را در ريشه رقم قدس القاء نمود تعداد باكتريها از هر دو سويه در ريشه رقم اميد كمتر از دو رقم ديگر بود و پارامترهاي فوق در ريشه رقم اميد آغشته به سويه هاي باكتري كمتر متأثر شدند.

در آخرين آزمايش اثر آلوده سازي با اين دو سويه روي سه رقم گندم در يك شرايط گلخانه اي بررسي گرديد. آلوده سازي با باكتري، ميزان محصول، وزن هزار دانه،‌تعداد دانه در سنبله، وزن خشك ريشه و ساقه و محتواي N.P.K در ارقام گندم را افزايش داد. ميزان اين تاثير كاملا وابسته به تركيب سوش- رقم زراعي بود. اين يافته ها پيشنهاد مي كند كه اثرات چشمگير آزوسپيريلوم روي نمو گياه در مراحل ا وليه رشد گياه القاء مي‌شود و سلولهاي باكتري مي توانند رشد و متابوليسم گياه گندم را بطور برگشت ناپذيري در مراحل اوليه پس از جوانه زني تحت تاثير قرار دهند.