تحصيلات تکميلي

نام و نام خانوادگي : زهرا اعتمادي فر

دانشكده : علوم

استاد راهنما : دکتر گيتي امتيازي- دكتر ايرج نحوي

تاريخ دفاع : 24/4/87

رشته و گرايش : ميكروبيولوژي

استاد مشاور : دکتر سيد حميد زركش

بهينه سازي فيزيولوژيكي و ژنتيكي سولفورزدايي از دي‌بنزوتيوفن توسط ميكروارگانيسم‌ها

چكيده

سوخت‌هاي حاصل از نفت حاوي انواعي از تركيبات آلي سولفوردار هستند، كه در هنگام سوختن آنها تركيب سمي سولفور دي‌اكسيد توليد، و منجر به ايجاد آلودگي اتمسفر و خاك مي‌شود. طي مرحله هيدرودسولفوريزاسيون نفت خام در پالايشگاه براي حذف سولفور، تركيبات آلي سولفوردار شامل تيوفن‌ها مثل بنزوتيوفن و دي‌بنزوتيوفن (DBT) بدون تغيير باقي مي‌مانند؛ تركيب DBT اغلب به عنوان يك مدل براي جداسازي باكتري‌هايي با قدرت حذف انتخابي سولفور جهت كاربرد در سولفورزدايي از سوخت‌هاي نفتي و تكميل پالايش آن استفاده شده است.

اهداف اين پايان نامه مشتمل بر جداسازي و بررسي ميكروارگانيسم‌هاي بومي سولفورزدا در ايران، بررسي پروفايل پلاسميدي آنها، بررسي نقش پلاسميدهاي جدا شده در تجزيه يا گوگردزدايي از DBT، بهينه‌سازي شرايط فيزيولوژيك سولفورزدايي از DBT، مطالعه تنفس و تشكيل بيوفيلم سويه‌هاي جداسازي شده در محيط حاوي DBT، انتقال پلاسميد سولفورزدايي به سويه‌هاي HBP-منفي شامل اشرشيا كلي و رودوكوكوس و ساختن سويه‌هاي نوتركيب با شرايط بهينه سولفورزدايي بوده است.

براي رسيدن به اهداف فوق، جداسازي ميكروارگانيسم‌هاي سولفورزدا بر محيط استاندارد جداسازي حاوي DBT انجام گرفت. سويه‌هاي جدا شده به وسيله تست‌هاي مورفولوژيكي و بيوشيميايي شناسايي شدند. يكي از باكتري‌هاي جدا شده كه فعاليت بالايي از سولفورزدايي نشان داد، با استفاده از روش‌هاي مولكولي شامل تهيه پروفايل پروتئيني و تعيين توالي ژن 16S rRNA هم شناسايي گرديد. سولفورزدايي از DBT با استفاده از تست گيبس براي بررسي توليد 2-هيدروكسي‌بي‌فنيل (HBP)، اندازه‌گيري جذب اختصاصي DBT با استفاده از طيف‌سنج UV، و همچنين تكثير PCR ژن dszC در باكتري جدا شده تعيين گرديد. شرايط بهينه سولفورزدايي در باكتري‌ها و مخمر جدا شده، همچنين ميزان تنفس و تشكيل بيوفيلم آنها در محيط سولفورزدايي به وسيله سنجش در ميكرو پليت بدست آمد. پلاسميد سنگين با روش تغيير يافته ليز قليايي جداسازي، و با پاساژهاي متوالي بر محيط غني موتان‌هاي گيبس منفي از سويه باكتري جدا شده تهيه گرديد. پلاسميد طبيعي جدا شده از سويه بومي به سلول‌هاي مستعد اشرشياكلي و پروتوپلاست‌هاي رودوكوكوس با فنوتيپ Dsz-منفي انتقال داده شد تا سويه نوتركيب رودوكوكوس Dsz-مثبت بدست آيد. همچنين بخشي از ژن dszC به طول bp400 به وسيله PCR تكثير، و در وكتور pET 28a كلون گرديد. پلاسميد كلون شده ابتدا به اشرشياكلي BL21، و پس از تكثير در اين باكتري، به سويه بومي R1 انتقال داده شد.

در ميان ميكروارگانيسم‌هاي جداسازي شده يك سويه باكتريايي با توانايي بالاي سولفورزدايي از DBT از خاك آلوده به گازوئيل در اصفهان براي مطالعات بعدي انتخاب گرديد. اين سويه با استفاده از مسير متابوليكي 4S، سولفورزدايي از DBT را با توليد HBP به عنوان محصول نهايي انجام داد، و جذب اختصاصي مربوط به DBT پس از سه روز در محيط حاوي اين باكتري به صفر رسيد. سويه فوق به وسيله تست‌هاي شناسايي مختلف تحت نام رودوكوكوس اريتروپوليس سويه R1 شناخته شد. رودوكوكوس سويه R1 توانايي سولفورزدايي سريع را در محيط حاوي DBT به عنوان تنها منبع سولفور داشت. شرايط اپتي‌مم سولفورزدايي از DBT به وسيله سنجش در ميكرو پليت بدست آمد، و نتايج نشان داد كه سويه R1 در غلظت‌هاي بالاي DBT رشد نموده، فعاليت متابوليكي خود را حفظ كرده، و تشكيل بيوفيلم هم مي‌دهد. بنابراين، سويه فوق مي‌تواند براي حذف DBT از محيط‌هاي مختلف بكار برده شود.

پلاسميدهاي سنگين از سويه R1 جداسازي، و به وسيله الكتروفورز خطي جدا گرديد، و با توجه به اينكه در سويه‌هاي موتان فاقد پلاسميد صفت سولفورزدايي از دست رفت، اين پلاسميد مسئول ايجاد فنوتيپ سولفورزدايي در سويه R1 شناخته شد. پلاسميدهاي طبيعي سنگين سويه بومي R1 به وسيله انتقال به واسطه PEG به پروتوپلاست يك سويه Dsz-منفي (رودوكوكوس اريتروپوليس 68) سبب توليد يك موتان پايدار سولفورزدا (سويه موتان mut23) گرديد. رودوكوكوس اريتروپوليس سويه R1 و سويه ترانسفورمه شده رودوكوكوس (mut23)، قادر به تجزيه کامل DBT طي سه روز بودند.

مخمر جدا شده، كه قادر به مصرف DBT به عنوان تنها منبع سولفور در محيط كشت بود، گونه‌اي از جنس تريكوسپورون شناسايي گرديد. اين بيوكاتاليست علاوه بر حذف DBT، قابليت حذف تركيبات سمي فنل و HBP را هم نشان داد.

بيوكاتاليست‌هاي جداسازي شده در اين پايان نامه، همچنين رودوكوكوس نوتركيب بدست آمده با توانايي بيشتر براي سولفورزدايي، مي‌توانند كانديداهايي براي سولفورزدايي از نفت خام هيدرودسولفوريزه شده در پاليشگاه محسوب شوند.

واژه هاي کليدي: دي‌بنزوتيوفن، رودوكوكوس اريتروپوليس، ژن dszC، سولفورزدايي، مخمر