تحصيلات تکميلي

نام و نام خانوادگي : پرژك ذوفن

دانشكده : علوم

استاد راهنما : دکتر منصور شريعتي

تاريخ دفاع : 26/9/87

رشته و گرايش : زيست شناسي-فيزيولوژي گياهي

استاد مشاور : -

فيزيولوژي جذب نيترات توسط ناقل NRT2.1 در گياه ترانسژني تنباكو (Nicotiana plumbaginifolia)

چكيده

نيتروژن يک عنصر غذايي ضروري و مهم براي رشد و نمو گياه است که به صورت مخلوطي از ترکيبات آلي و معدني در محلول خاک وجود دارد. اکثر گياهان عالي نيتروژن مورد نياز خود را از تثبيت نيترات و آمونيوم به دست مي آورند. نيترات يکي از مهمترين منابع نيتروژن معدني براي گياهان مي باشد. جذب نيترات توسط سلول هاي ريشه، يک فرآيند بسيار کليدي و حياتي در گياهان عالي است زيرا به عنوان اولين مرحله از مسير تثبيت نيترات در نهايت منجر به توليد بسياري از ترکيبات نيتروژن دار آلي جهت سنتز مولکول هاي زيستي نظير پروتئين ها و نوکلئيک اسيدها مي گردد. مطالعات کينتيک جذب نيترات نشان داده است که حداقل سه سيستم انتقال نيترات در ريشه گياهان حضور دارد. سيستم هاي با تمايل پائين LATS (Low–affinity transport system) که در غلظت هاي بيش از 5/0 ميلي مولار نيترات فعال هستند و سيستم هاي با تمايل بالاي HATS (High–affinity transport system) که در غلظت هاي کمتر از 5/0 ميلي مولار عمل مي کنند و خود به دو گروه ساختاري cHATS (constitutive HATS) و القايي iHATS (inducible HATS) تقسيم مي شوند. تحقيقات جذب نيترات در سطح مولکولي بيانگر آن است که سيستم هاي LATS توسط خانواده ژني NRT1 و سيستم هاي HATS به واسطه خانواده ژني NRT2 کد مي شوند. در گياهان در ميان ژن هاي خانواده NRT2 بيشتر مطالعات فيزيولوژيکي و مولکولي مرتبط با جذب نيترات بر روي ژن NRT2.1 متمرکز شده است. پيشنهاد شده است که ژن فوق به همراه ژن هايي نظير NRT2.2 و NRT3.1 نقش مهمي را در جذب نيترات به واسطه iHATS ايفاء مي کند. بنابراين با توجه به اهميت سيستم HATS در جذب نيترات و درک بهتر و بيشتر نقش آن و عوامل موثر در کنترل فعاليت و بيان آن در گياهان عالي و نظر به اينکه برخي مطالعات نشان مي دهد که بيان ناقل NRT2.1 وابسته به بيان ژن هاي ديگر است، در اين تحقيق از دو گياه مدل Nicotiana plumbaginifolia و Arabidopsis thaliana در طي دو بخش تحقيقي استفاده گرديد. در بخش اول، گياهان تراريخته تنباکو که حامل ژن هاي AtNRT2.1 و AtNRT3.1 از گياه Arabidopsis به همراه مارکر ژني مقاوم به آنتي بيوتيک کانامايسين بودند و در بخش دوم گياهان Arabidopsis داراي اختلال در بيان ژن هاي AtNRT2.4 و AtNRT2.5 به صورت موتانت يا تراريخته با زمينه ژنتيکي متعلق به دو اکوتيپ Columbia (Col) و Wasselewkija (WS)جهت تعيين نقش اين ژن ها در عملکرد HATS مورد بررسي قرار گرفتند. در بخش اول تحقيق، تاثير غلظت نيترات و اسيد آمينه گلوتامين بر روند و نرخ جذب نيترات در طي زمان با روش Ion depletion در شرايط آب کشتي بررسي گرديد. پس از تائيد هموزيگوسيتي گياهان تراريخته تنباکو براي ژن انتقالي از طريق کشت بر روي محيط جامد MS داراي يا بدون آنتي بيوتيک کانامايسين، حضور ژن انتقالي از طريق PCR و الکتروفورز مورد تائيد قرار گرفت. براي کليه آزمايشات مرتبط با بخش اول تحقيق، بذرها ابتدا در گلدان کشت و پس از 30 روز به محيط کشت هاي آب کشتي با شرايط نوري و دمايي کنترل شده انتقال يافتند. بررسي نرخ و روند جذب غلظت هاي 10، 50، 75، 100 و 150 ميکرو مولار نيترات جهت انتخاب غلظت مناسب در محدوده عملکرد HATS نشان مي دهد که احتمالا غلظت 10 ميکرو مولار توسط سيستم cHATS و غلظت هاي بين 50 تا 150 ميکرو مولار با واسطه فعاليت توام cHATS و iHATS در ريشه گياهان وحشي جذب مي شوند. بررسي نرخ جذب غلظت 150 ميکرو مولار نيترات در گياهان وحشي و تراريخته تنباكو بيانگر آن است که گياهان وحشي با يک تاخير تقريبا 2 ساعته در مقايسه با گياهان تراريخته جذب نيترات از محيط را آغاز مي کنند و بعد از دو ساعت تفاوت معني داري بين اين دو ژنوتيپ مشاهده نمي شود. به نظر مي رسد که تشديد بيان ژن انتقالي در گياهان تراريخته منجر به حذف سريع تر و زودتر نيترات و نه جذب بيشتر آن در 2 ساعت اول بعد از افزودن نيترات در قياس با تيپ وحشي مي گردد. بررسي اثر پيش تيمار 48 ساعته 10 ميلي مولار نيترات بر روي نرخ و روند جذب نيترات بيانگر آن است که اين غلظت، نرخ جذب نيترات را براي هر دو ژنوتيپ تنباكو به ويژه در طي 2 ساعت اول آزمايش به طور يکساني افزايش مي دهد. بر اساس نتايج حاصل از اين تحقيق افزودن 1 ميلي مولار گلوتامين به محيط کشت منجر به کاهش نرخ جذب نيترات توسط HATS در هر دو ژنوتيپ تنباكو مي گردد. با اين وجود، اثر مهاري آن بر گياهان تراريخته کمتر مي باشد. در بخش دوم تحقيق گياهان Arabidopsisموتانت و تراريخت در ژن هاي AtNRT2.4 و AtNRT2.5 با دو اكوتيپ Columbia (Col) و (WS) Wasselewkija بر روي شن و در شرايط کنترل شده نوري و دمايي کشت شدند. پس از 35 روز، برخي از گياهان تحت عنوان برداشت T0 جمع آوري و بلافاصله شرايط محروميت نيتروژن بر باقي مانده گياهان اعمال گرديد. با برداشت گياهان در روزهاي دهم (T10) و هفدهم (T17) پس از برقراري شرايط محروميت نيتروژن، برخي شاخص هاي فيزيولوژيکي و مولکولي نظير بيوماس، درصد نيتروژن کل، ميزان اسيد آمينه هاي کل و ميزان نيترات ساقه و ريشه و سطح بيان ژن هاي AtNRT2.1، AtNRT2.4 و AtNRT2.5 از طريق Real-Time PCR مورد بررسي قرار گرفت. به طور کلي نتايج حاصل از بررسي بيوماس نشان مي دهد که محروميت نيتروژن منجر به کاهش نسبت رشد ساقه به ريشه براي همه ژنوتيپ هاي مورد مطالعه مي گردد. همچنين اين نتايج بيانگر آن است که 10 روز محروميت نيتروژن در اکثر موارد باعث کاهش ميزان نيترات، درصد نيتروژن و افزايش اسيد آمينه در بخش هاي هوايي و ريشه ها مي شود. نتايج به دست آمده از آناليز کمي بيان ژن حاکي از آن است که با برقراري و تداوم شرايط محروميت نيتروژن بيان ژن AtNRT2.1 کاهش مي يابد در حالي که بيان ژن هاي AtNRT2.4 و AtNRT2.5 افزايش مي يابد. بررسي نرخ جذب 15NO3 و همچنين نتايج حاصل از بررسي وضعيت رشدي گياهان موتانت دوگانه atnrt2a (داراي نقص در فعاليت iHATS) تراريخته شده با ژن هاي AtNRT2.4 و AtNRT2.5 نشان مي دهد که اين ژن ها مشارکت مستقيم در جذب نيترات به واسطه HATS ندارند. در يک جمع بندي کلي بر اساس نتايج حاصل از اين بررسي به نظر مي رسد که نيترات و گلوتامين نقش مهمي را در کنترل بيان ناقل NRT2.1 ايفاء مي کنند. در شرايط آزمايش ما، نيترات منجر به القاي فعاليت HATS مي شود، در حالي که گلوتامين اثر مهاري بر عملکرد HATS دارد. بر اساس اين نتايج به نظر مي رسد كه ژن AtNRT2.1 جزو ژن هاي القايي توسط نيترات و ژن هاي AtNRT2.4 و AtNRT2.5 جزو ژن هاي ممانعت شونده به واسطه نيترات باشند. با توجه به اين تحقيق تصور مي شود كه ناقلين AtNRT2.4 و AtNRT2.5 مشاركت مستقيم در جذب نيترات توسط HATS ندارند، اما ممكن است كه در انتقال نيترات از مخازن ذخيره اي سلول به سيتوپلاسم به ويژه در شرايط محدوديت نيتروژن ايفاي نقش نمايند. علاوه بر اين، با توجه به نتايج حاصل از مطالعه گياهان موتانت و تراريخته در ژن هاي AtNRT2.4 و AtNRT2.5 به نظر مي رسد که 10 روز محروميت نيتروژن به عنوان يک نقطه بحراني در شرايط آزمايشي اين تحقيق مي تواند باعث فعال شدن مسيرهاي سيگنالي مرتبط با فقر و کمبود نيترات در گياه شود، زيرا شاخص هاي مرتبط با متابوليسم نيتروژن و بيان برخي از ژن ها تغييرات معني داري را در اين زمان از خود نشان مي دهند.

واژه هاي كليدي: نيترات، گلوتامين، HATS، Nicotiana plumbaginifolia، Arabidopsis thaliana، ژن هاي AtNRT2.1، AtNRT2.4 و AtNRT2.5